外周血单个核细胞（PBMC）是免疫学研究的关键材料，包括淋巴细胞和单核细胞。其在疾病机制探索、疫苗研发及个性化医疗中具有重要作用。本文详细介绍标准化的PBMC分离流程——密度梯度离心法，以帮助科研人员高效获取高纯度样本。
一、核心分离原理
密度梯度离心法利用不同细胞密度的物理特性，通过离心力实现分层：
-试剂选择：采用Ficoll分离液（密度约1.077 g/mL），其密度介于血浆（≈1.025 g/mL）与红细胞/粒细胞（＞1.092 g/mL）之间。
-分层机制：离心后，PBMC集中于分离液上层，而红细胞、粒细胞沉于管底，血小板则悬浮于血浆中。
二、标准化操作步骤
1.样本准备：
-采集新鲜肝素抗凝血，室温保存（避免低温导致细胞聚集）。
-用PBS以1:1比例稀释血液，降低粘度。
2.梯度离心：
-将稀释血样缓慢叠加至Ficoll液面上（比例建议2:1）。
-离心条件：20℃、400×g，持续30分钟（务必水平离心）。
3.PBMC收集：
-离心后，吸取白膜层（云雾状界面），转移至新管。
-PBS洗涤两次（250×g离心10分钟），去除残留血小板与分离液。
4.细胞计数与保存：
-台盼蓝染色法评估细胞活性（＞95%为佳）。
-立即用于实验，或液氮冷冻保存。
三、关键注意事项
-温度控制：全程保持室温（18–25℃），低温易致单核细胞黏附。
-操作轻柔：吸取界面时避免扰动分层，确保细胞完整性。
-样本时效：血液需在8小时内处理，久置降低细胞活性。
四、应用场景与技术优势
PBMC分离技术广泛应用于：
-免疫治疗：CAR-T细胞制备、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）研究。
-疾病诊断：HIV病毒载量检测、自身免疫性疾病分析。
-药物研发：疫苗效价评估、免疫调节剂筛选。
精准的PBMC分离是免疫学研究的基石。通过标准化操作，可确保细胞的高活性和功能性。
